十问十答|关于液相色谱柱使用中的常见问题解答(一)

2024年3月08日

第一期 关于液相色谱柱使用中的常见问题解答

1. 反相色谱柱,初次使用如何活化?


采用纯有机试剂(如甲醇、乙腈),从0.1mL/min流速慢慢提高到正常使用流速,冲洗总体积以20倍柱体积为宜,以便固定相能充分润湿、碳链舒展彻底,使色谱柱的性能达到最好状态,并观察压力和基线状态。

柱体积计算参照公式:

柱体积=π*(I.D./2)2 *L*60%

常见的色谱柱规格的柱体积计算如下:

2.正相/HILIC色谱柱,新柱使用如何活化?


正相色谱柱 (SIL, DIOL,CN,NH2)封存溶剂与质控方法相关,不同的封存溶剂活化存在差异,以岛津现有的色谱柱为例,具体活化方法如下:

不同方法如下:

3. HILIC模式色谱柱如何清洗保存?


采用HILIC模式对样品进行分离分析,一般用于分离大极性化合物,因此对于极性大、吸附太强的杂质,常规清洗效果不明显,可以加大水比例,增加洗脱强度,先用纯水:乙腈=50:50,清洗20倍柱体积,然后梯度过渡到95%乙腈清洗,并最终保存在该流动相中。

4. 什么情况下反冲?多采用什么方法反冲?


当流动相中使用了时间长,且缓冲盐使用较多;或者等度高比例水相一段时间造成了柱头严重污染,常规的冲洗难以达到一个好的效果,此时可以进行反冲。

反冲程序为0.3%的磷酸乙腈水(900mL乙腈+100mL水,再加3mL磷酸),反接色谱柱,0.5mL/min,冲洗2h,或者过夜处理。

5. 选择保护柱应该注意什么?保护柱怎么再生?


除非特殊情况,一般选择填料基质与分析柱基质完全相同的保护柱保护柱,确保,确保分离选择性一致;规格选择方面,尽量选择粒径一致或者相近的保护柱,且耐压符合要求,保护柱体积按分析柱体积的5%~10%,保护柱内径应与分析柱内径相同或相当。

保护柱的再生一般采用,取下保护柱,在不打开卡套的前提下将保护柱反接(注意此时不能接色谱柱),用10%甲醇水冲洗  30min,然后再用纯甲醇冲洗30min。

6.反相色谱分离分析中,流动相添加四氢呋喃有什么作用?四氢呋喃对于色谱柱和仪器有什么影响吗?


四氢呋喃(THF)在反相色谱中,洗脱能力比甲醇和乙腈要强。实验结果表明,在流动相中加入THF能改善某些难分离的物质的分离度及峰形。

但是THF也存在不稳定,易降解生成过氧化物,从而导致峰形拖尾、峰分裂以及鬼峰;同时过氧化物还可与填料发生化学作用,一定程度上,THF会对柱子造成损伤,而且这种损伤随着时间而累积;再者THF对PEEK有腐蚀作用,因此添加浓度一般不超过20%。

7.鬼峰的主要来源有哪些?怎么消除?


1. 梯度变化造成的,在紫外低波长检测的条件下会更容易出现,这种鬼峰比较固定;一般磷酸盐体系更容易出现鬼峰,建议添加鬼峰捕集小柱去除。

2. 仪器中管路有气泡也会容易产生鬼峰,但这种鬼峰一般保留时间不固定,在进行实验的时候,首先对流动相进行脱气处理,同时更换流动相后,对仪器管线进行Purge。

样品的降解变质,以及样品本身可能带有的,但因样品批次问题可能不固定出现;需要进一步的排查。

流动相、仪器系统(包括手动进样的进样针)、色谱柱或样品污染带来的,需要冲洗液相色谱系统。

残留在柱子上,前一阵洗脱不完全导致在下一针出峰,从而导致鬼峰,建议更换洗针液。

8.保护柱和在线过滤器都可以起到保护色谱柱的作用,二者有什么区别?


在线过滤器内的滤芯是具有一定孔径的筛板,死体积更小,只能过滤掉一些大于筛板孔径的杂质。清洗的时候,只要取下筛板超声即可。

保护柱的卡套中放置的是保护柱芯,柱芯内有填料,相较于在线过滤器,死体积更大。保护柱芯不仅能过滤固体杂质,还能吸附一些强极性、强酸性或者强碱性的物质,防止色谱柱内填料的污染,可以对色谱柱进行全方位的保护。

9. 液相色谱柱的接头不匹配是什么问题?


通常液相色谱柱的柱头也有不同类型,常见的有HSS型以及W型,最大的差别在于连接所用的接头管线伸出来长度有差异,HSS型为2.4mm,W型则为3.3mm。当使用一些不锈钢接头的时候,接头卡死导致伸出长度固定,难以匹配不同类型色谱柱。

选择岛津杂化耐高压接头,最高耐压82Mpa,接头不会卡死,灵活匹配各种柱头类型,搭配手拧工具,轻松搞定连接。

10. UPLC色谱柱分离分析也面临鬼峰干扰,怎样做到不增加系统体积消除鬼峰?


岛津全新升级推出鬼峰吸滤头—GLC Suction Filter 2,代替原有砂芯滤头,在不增加仪器系统体积的同时,滤头中的填料起到有效净化流动相,吸附流动相中有机杂质,从而消除鬼峰。

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